Arbeitsgruppe Prof. Dr. M. Thomm
Mitarbeiter an diesem Thema: Mirijam Zeller


Struktur-Funktionsbeziehung der Transkriptionsmaschinerie von P. furiosus

 

1) Überblick und Zusammenfassung

a.) Die archaeelle Transkriptionsmaschinerie

Alle Lebewesen und Zellen benötigen eine RNA Polymerase zur Synthese verschiedenster RNAs. Während die bakterielle RNA Polymerase lediglich aus 5 Untereinheiten besteht, besitzen Archaeen eine RNA Polymerase, die sich aus 11 oder 12 Untereinheiten zusammensetzt und am meisten der eukaryotischen RNA Polymerase II ähnelt (Abb.1). Im Gegensatz zu allen eukaryotischen Zellen, ist in Archaeen eine einzige RNAP für die Transkription von allen, nämlich sowohl Protein- als auch RNA-kodierenden Genen verantwortlich.

Ebenfalls hoch konserviert sind die generellen Transkriptionsfaktoren TATA Bindendes Protein (TBP – in Eukaryoten eine Untereinheit von TFIID), Transkriptionsfaktor B (TFB – in Eukaryoten TFIIB) sowie Transkriptionsfaktor E (TFE – der N-terminaler Teil der großen Untereinheit a des eukaryotischen TFIIE).

 
Abb.1: Gegenüberstellung der RNAP Untereinheiten in Bakterien, Archaeen und Eukaryonten. Homologe Untereinheiten sind in derselben Farbe dargestellt (1).

 

Gegenüberstellung der RNAP Untereinheiten in Bakterien, Archaeen und Eukaryonten

b.) Untersuchung zu Interaktionen einzelner Untereinheiten der RNAP von P. furiosus

Die Klonierung und Expression der 11 RNAP Untereinheiten (B, A’, A’’,D, E’, F, H, L, H, P, N und K) sowie der beiden Faktoren TBP und TFB des hyperthermophilen Archaeons Pyrococcus furiosus erlaubte uns eine detaillierte Analyse der Protein-Protein-Interaktionen zwischen allen Polypeptiden der basalen archaeellen Transkriptionsmaschinerie (1). Abb. 2 fasst die über Far Western Analyse gezeigten Interaktionen zwischen RNAP Untereinheiten von P. furiosus zusammen.

Interaktionsnetzwerke der Untereinheiten von archaeeller und eukaryotischer RNAP im Vergleich
Abb.2 Die Interaktionsnetzwerke der Untereinheiten von archaeeller und eukaryotischer RNAP im Vergleich.
Links sind die Interaktionen innerhalb der Pyrococcus RNAP basierend auf einer Far Western Analyse gezeigt. Die Dicke der Verbindungslinien gibt eine Schätzung der Interaktionsstärke wieder, wobei eine Interaktion entweder von einem (blaue Linie) oder von beiden (rote Linie) Bindungspartnern nachgewiesen wurde.
Rechts ist ein modifiziertes Diagramm basierend auf der Kristallstruktur der RNAP II von S. cerevisiae (2,3) gezeigt. Homologe Untereinheiten sind in derselben Farbe dargestellt.
Aufgrund der großen Sequenzhomologien und dem sehr ähnlichen Interaktionsnetzwerk der RNAP Untereinheiten, erwartet man eine ebenfalls sehr große strukturelle Ähnlichkeit zwischen archaeeller und eukaryotischer RNAP. Neueste cryo-elektronenmikroskopische Daten der RNAP von P. furiosus konnten diese Annahme sehr gut bestätigen (4).

c.) Rekonstitution der RNAP

Im Zuge unserer Untersuchungen zum Mechanismus der archaellen Transkription ist es uns schließlich gelungen, eine hoch aktive RNAP aus 11 bakteriell exprimierten Untereinheiten von P. furiosus (B, A’, A’’,D, E’, F, H, L, H, P, N und K) zu rekonstitutieren ((5) Abb. 3). Diese Untereinheiten werden unter jeweils denaturierenden oder nicht denaturierenden Bedingungen gereinigt und in equimolaren Mengen vereinigt. Nach schrittweiser Dialyse gegen Transkriptionspuffer (mit 6, 3 und 0 M Harnstoff) und einem Gelfiltrationsschritt, kann in Gegenwart von TBP und TFB die spezifische Transkriptionsaktivität am Glutamat-Dehydrogenase (gdh) Promoter von P. furiosus nachgewiesen werden.

aufgereinigte RNAP Untereinheiten

Abb. 3 Rekonstitution der P. furiosus RNAP.
Links: 11 aufgereinigten RNAP Untereinheiten, welche in E. coli kloniert und exprimiert wurden, Coomassie Blue Stain eines SDS PA-Gels. M, Marker. Pfu RNAP, endogene RNA Polymerase aus P. furiosus. Die jeweilige Untereinheit ist in jeder Spur unter dem Gel gekennzeichnet.
Rechts, oben: Gelfiltration (Superdex 200) der rekonstitutierten RNAP.
Rechts, unten: Aktivitätsnachweis in Fraktionen 18-25 mittels in vitro Transkription.


2.) Forschungsschwerpunkt: Struktur-Funktionsbeziehung der Transkriptionsmaschinerie von P. furiosus 

Die Rekonstitution der vollständig rekombinanten RNAP von P. furiosus ermöglicht die Herstellung sowie die gezielte in vitro Funktionsanalyse von Punkt und Deletionsmutanten des ca. 400 kDa großen Enzyms (5). Bis heute ist selbiges mit noch keiner eukaryotischen RNAP möglich.

Der hohe Konserviertheitsgrad zwischen den eukaryotischen und archaellen Untereinheiten erlaubt eine eindeutige Zuordnung homologer Aminosäuren bzw. distinkter struktureller Bereiche.
Beim Design der zu untersuchenden Mutanten orientieren wir uns an den bereits zahlreich vorhandenen Strukturdaten eukaryotischer RNAPs, vornehmlich an der der RNAP II von S. cerevisiae. Dies geschieht in einer Kollaboration mit P. Cramer (Genecenter München).

Die konkreten Fragestellungen ergeben sich dabei aus den verschiedenen Phasen des Transkriptionszyklus einerseits (Abb. 4), sowie der RNAP Struktur andererseits.

Phasen der Transkripition
Abb.4 Die einzelne Phasen der Transkription. Der Transkriptionszyklus beginnt damit, dass die RNAP an der Promoter DNA mit den beiden generellen Transkritptionsfaktoren TBP und TFB assoziiert (Bildung des geschlossenen Komplexes). Dieser Komplex bewirkt das Aufschmelzen der DNA-Doppelhelix (Bildung des offenen Komplexes). Die Polymerase beginnt damit, kurze RNA Oligonukleotide zu synthetisieren, welche zunächst oftmals freigesetzt werden (abortive Transkription). Wenn das RNA Produkt eine bestimmte Länge erreicht hat, befindet sich die RNAP in der Elongationsphase. Das Enzym elongiert nun die RNA, schmilzt die downstream DNA auf und schließt die Transkriptionsblase im upstream Bereich. Schließlich kommt es zur Termination, wobei RNA und DNA freigesetzt werden.

a.) Elongation

Von hervorstehendem Interesse ist hier die Untersuchung hochkonservierter Schleifen in der DNA bindenden Spalte des Enzyms oberhalb des aktiven Zentrums. Diese umfassen Lid, Rudder, Fork Loop 1 und Fork Loop 2. Außerdem wird im speziellen die Rolle von 3 basischen Seitenkettenresten, welche sich im Switch 2 Element (Arg313, Lys330) und in Fork Loop 2 (Arg445) befinden, analysiert (6).

b.) Initiation der Transkription

Es sind bereits detaillierte kristallographische Daten zu TBP-TFB-DNA sowie zu Polymerase-DNA Komplexen vorhanden, jedoch konnte bislang kein vollständiger Präinitiationskomplex (PIC: TBP-TFB-Polymerase-DNA) strukturell aufgelöst werden.

Bisherigen Strukturinformationen sowie Protein-Protein-Crosslinking Daten werden herangezogen, um Punktmutationen in TFB und der RNAP zu entwerfen, die zur Aufklärung des komplexen Überganges vom PIC zum elongierenden Komplex beitragen sollen.



Referenzen:

Goede, B., Naji, S., von Kampen, O., Ilg, K. & Thomm, M. Protein-protein interactions in the archaeal transcriptional machinery: binding studies of isolated RNA polymerase subunits and transcription factors. J Biol Chem 281, 30581-92 (2006).

Bushnell, D.A., Cramer, P. & Kornberg, R.D. Structural basis of transcription: alpha-amanitin-RNA polymerase II cocrystal at 2.8 A resolution. Proc Natl Acad Sci U S A 99, 1218-22 (2002).

Armache, K.J., Kettenberger, H. & Cramer, P. Architecture of initiation-competent 12-subunit RNA polymerase II. Proc Natl Acad Sci U S A 100, 6964-8 (2003).

Kusser, A. et al. Structure of an archaeal RNA polymerase. J Molecular Biology (2007).

Naji, S., Grunberg, S. & Thomm, M. The RPB7 orthologue E' is required for transcriptional activity of a reconstituted archaeal core enzyme at low temperatures and stimulates open complex formation. J Biol Chem 282, 11047-57 (2007).

Naji, S., Bertero, B., Spitalny, P., Cramer, P. & Thomm, M. Structure-function analysis of the RNA polymerase cleft loops elucidates initial transcription, DNA unwinding, and RNA displacement. Nucleic Acids Res (2007).