Mitarbeiter an diesem Thema: Dr. Harald Huber, Prof. Dr. Michael Thomm


Isolierung, Kultivierung und Charakterisierung neuartiger hyperthermophiler Archaeen aus Hochtemperaturökosystemen


Hyperthermophile Vertreter der Archaeen (d.h. Organismen mit optimalen Wachstumstemperaturen über 80°C) konnten bislang aus zahlreichen kontinentalen Hochtemperaturökosystemen unserer Erde isoliert werden, wie z. B. aus Island, Italien oder dem Yellowstone National Park, sowie aus untermeerischen Hydrothermalsystemen wie beispielsweise dem Mittelatlantischen Rücken oder dem Südpazifischen Rücken. Diese Mikroorganismen repräsentieren tiefabzweigende Linien im Stammbaum des Lebens und sind daher auch evolutionsgeschichtlich von großem Interesse. Schwerpunkte der Forschung sind die Anreicherung dieser Organismen, Entwicklung neuer Kultivierungstechniken, die physiologisch- biochemische und molekulare Charakterisierung der isolierten Stämme sowie deren phylogenetische Einordnung. Im institutseigenen Biotechnikum werden diese Organismen auch in größerem Maßstab gezüchtet (bis 300 l), wobei von uns auch Optimierungen der Anzuchtbedingungen und der Kulturmedien (z.B. auch durch ICP-Analysen) durchgeführt werden.

 

Biotope:

Biotop auf Lesbos

Prof. Thomm bei der Probennahme

 

Biotop auf Lesbos

Abb. 1: Probennahme an den heißen Quellen im Gebiet von Polichnitos, Insel Lesbos, Griechenland (Temperaturen bis 88 °C)

 

Kultivierung extrem anaerober Mikroorganismen:

Am Lehrstuhl für Mikrobiologie werden anaerobe Medien in einem speziell dafür eingerichteten Raum hergestellt. Die entsprechenden Flüssigmedien werden zunächst aerob hergestellt; an einer Gasstation wird anschließend ein Großteil des vorhandenen Sauerstoffs durch Durchgasen mit Inertgas (N2) ausgetrieben. Durch Zugabe von z.B. Na2S wird der Rest-Sauerstoff chemisch gebunden. In einer Anaerobenkammer (Abb. 2) - der darin vorhandene Sauerstoffgehalt liegt unter 5 ppm und wird ständig kontrolliert - wird das Medium in Serumflaschen abgefüllt und diese dann mit Gummistopfen verschlossen. [Ins Anaerobenzelt diffundierender Sauerstoff wird darin katalytisch zu H2O verbrannt]. Außerhalb der Anaerobenkammer werden die Serumflaschen 3 x im Schutzkäfig mit dem gewünschten Gasgemisch (z.B. H2/CO2 im Verhältnis 80:20 für Methangas-bildende Archaea) be- und entgast (1 bar Überdruck). Schließlich kann normal autoklaviert werden. Gegebenenfalls müssen vor dem Animpfen noch Supplemente (z.B. Hefe-Extraktlösung, ebenfalls anaerob hergestellt) zugespritzt werden.

 

Anaerobenkammer Abb. 2: Anaerobenkammer

 

Isolierung hyperthermophiler und extrem anaerober Mikroorganismen:

Zum Erhalt von Reinkulturen wurde eine neuartige, plattierungsunabhängige Isolierungsmethode für Mikroorganismen entwickelt, die auf dem Einsatz der Laserpinzette beruht. Diese Methode wird bevorzugt in Forschungsgebieten eingesetzt, in denen die üblichen Methoden zum Erhalt von Reinkulturen (z. B. durch Plattieren) nicht mehr greifen.

Bei der als Laserpinzette, optischen Pinzette oder Laserfalle bezeichneten Mikromanipulationstechnik wird über einen zusätzlichen Strahlengang Laserlicht in ein Inversmikroskop eingespiegelt (Abb. 3). Durch starke Bündelung des Laserstrahls („Lichtdruck”) können Kräfte erzeugt werden, die es erlauben, Zellen oder subzelluläre Partikel im Laserfokus unter gleichzeitiger mikroskopischer Beobachtung zu fixieren und ähnlich einer mechanischen Mikropinzette in drei Dimensionen zu bewegen. Die zum Fangen nötige „optische Falle” wird hierbei durch Fokussierung des Laserstrahles (Durchmesser <1µm) mit einem Phasenkontrastobjektiv mit hoher numerischer Apertur gebildet.

       Aufbau Lasermikroskop Abb. 3: Schematischer Aufbau eines Lasermikroskops

Zur Isolierung von Einzelzellen wird eine dafür speziell entwickelte Zellisolierungseinheit verwendet. Diese besteht aus einer rechteckigen Glaskapillare als Mikroskopier- und Trennkammer (Innenmaße: 0,1 x 1 mm; Länge 10 cm), die über einen paßgenauen Schrumpfschlauch mit der Kanüle einer 1 ml-Einwegspritze verbunden ist (Abb. 4a; 1-4). Durch eine einseitig angebrachte Sollbruchstelle ist die Glaskapillare in zwei gleich große Kompartimente unterteilt (Abb. 4a; 5).

Die Befüllung der Isoliereinheit erfolgt normalerweise in einer Anaerobenkammer. Hierbei werden vom offenen Kapillarenende her zuerst ca. 90 Prozent der Kapillare mit sterilem Medium gefüllt, anschließend wird Kulturflüssigkeit nachgesaugt. Die Isoliereinheit wird am Mikroskoptisch (Abb. 3) in zwei Halteklammern eingespannt. Unter mikroskopischer Beobachtung kann nun aus der Mischkultur die gewünschte Einzelzelle ausgewählt und durch Aktivierung des Lasers im Laserfokus über dem Objektiv fixiert werden (Abb. 4a). Durch horizontales Verschieben des Mikroskoptisches wird die Zelle von der Mischkultur abgetrennt und über die Sollbruchstelle hinweg in den sterilen Kapillarbereich gebracht (Trennstrecke: 6 – 7 cm; Abb. 4b). Nach Beendigung des Trennvorganges (Dauer: 3-10 Minuten) wird die Kapillare an der Sollbruchstelle gebrochen (Abb. 4b) und die Einzelzelle in steriles Medium transferiert.

Schematische Darstellung der Einzelisolierung
Abb. 4: Schematische Darstellung der Einzelzellisolierung.
a: Mit Medium und Kultur befüllte Isolierungseinheit. Eine einzelne Zelle ist im Laserfokus über dem Objektiv fixiert. b: Die Einzelzelle befindet sich nach Abtrennung von der Mischkultur (Trennstrecke: 6-7cm) im sterilen Bereich der Kapillare. 1: Glaskapillare; 2: Schrumpfschlauch; 3: Kanüle; 4: Spritze; 5: Sollbruchstelle; 6: Mischkultur; 7: Objektiv.