Arbeitsgruppe Prof. Dr. M. Thomm
Mitarbeiter an diesem Thema: Sebastian Grünberg


Neue Einblicke in die Initiation und die Elongation in einem polII-ähnlichen Transkriptionssystem

 

Die Möglichkeit, eine aktive und hochreine RNA Polymerase (RNAP) aus ihren Untereinheiten rekonstituieren zu können, ermöglicht unter anderem die Untersuchung der Funktionen einzelner Untereinheiten des elf Untereinheiten umfassenden Holo-Enzyms der Pyrococcus furiosus RNAP. Das Holo-Enzym wird von zwei funktionellen Subkomplexen gebildet: Dem Core-Enzym, das aus neun Untereinheiten besteht und die DNA-bindende Spalte mit dem katalytischen Zentrum enthält und dem E’/F-Heterodimer.

Im Rahmen dieses Projektes konnte unter anderem die Funktion des lose mit dem Core-Enzym verbundenen E’F-Subkomplex, dem Homolog des eukaryotischen Rpb7/4 Komplexes der RNA Polymerase II (polII), analysiert werden.

Anhand von in vitro Transkriptionsversuchen wurde gezeigt, dass das Core-Enzym der RNAP unter optimierten Bedingungen einen vergleichbaren RNA-Synthese-Level aufweist wie das rekonstituierte Holo-Enzym. Bei niedrigen Inkubationstemperaturen allerdings war kaum Aktivität der Core-RNAP nachweisbar. Eine Zugabe der Untereinheit E’ führte zu einer deutlichen Aktivierung der Transkription. Kaliumpermanganat (KMnO4)-Footprinting Experimente zeigten, dass die Stimulation auf das Ausweiten der Transkriptionsblase in stromabwärts Richtung zurückzuführen ist. Analysen der Kristallstruktur des kompletten eukaryotischen polII-Komplexes und die oben genannten Ergebnisse lassen vermuten, dass die Ausweitung der Blase in dem E’-induzierten Schließen der RNAP-Klammer-Region und dem damit einhergehenden Aufschmelzen der DNA-Stränge begründet liegt (Abb. 1).

E'/F induziertes Schließen der RNAP-Klammer

Abb.1: A, Struktur des Core-Enzyms der polII (grau; nach Armache et al., 2003) mit dem gebundenen Heterodimer Rpb7 (blau)/4 (dunkelrot). Der kodierende DNA-Strang ist hellblau markiert, der nicht kodierende pink. Die Strukturen der Rpb1-Untereinheit, die die Klammer bilden, sind schwarz umrandet. B, schematische Darstellung von A nach Armache et al., 2003. Die Farbgebung der Rpb7/4 Untereinheiten entspricht A, das aktive Zentrum der RNAP ist rot gekennzeichnet. Die RNAP-Klammer ist in den beiden möglichen Konformationen dargestellt: die gestrichelte Linie entspricht der Positionierung im geöffneten Zustand, die durchgezogene Linie entspricht der Position der Klammer in dem Rpb7-induzierten geschlossenen Zustand.

Analysen des archaeellen Transkriptionsfaktors E (TFE), dem Homolog zu dem N-terminalen Teil der alpha-Untereinheit des eukaryotischen Transkriptionsfaktors TFIIE, haben eine duale Rolle des Faktors bei der Initiation aufgedeckt. Zum einen stabilisiert TFE Präinitiationskomplexe (PICs) des Core-Enzyms in Heparin-Kompetitions-Versuchen. Zum anderen aktiviert TFE die E’-induzierte Transkription des Core-Enzyms deutlich. KMnO4-Footprinting Studien konnten diesen stimulierenden Effekt auf eine allgemeine Stabilisierung der Transkriptionsblase sowie einer aktiven, TFE-induzierten Öffnung der stromaufwärts Grenze der Blase zurückführen. In Kooperation mit der Arbeitsgruppe von Mike Bartlett (Portland State University, Portland, Oregon, USA) wurde nachgewiesen, dass TFE im Bereich der Transkriptionsblase in PICs an den exponierten, nicht kodierenden Strang bindet, was vermutlich in einer Stabilisierung und Ausdehnung der Blase resultiert.

Anhand der gewonnen Ergebnisse konnte ein verfeinertes Modell für die Initiation der Transkription entworfen werden (Abb. 2). Nach der Rekrutierung des RNAP-Core-Enzyms (A) erfolgt die Ausbildung eines minimalen offenen Komplexes. Durch die Bindung des E’/F-Heterodimers an das Core-Enzym und das damit verbundene Schließen der RNAP-Klammer wird die minimale Transkriptionsblase in Stromabwärtsrichtung ausgeweitet (C), ein Schritt, der entscheidend für die Transkriptionsaktivität ist. Durch Bindung von TFE an den nicht kodierenden Strang im Bereich stromaufwärts des Transkriptionsstartpunkts wird die Blase stabilisiert und zu einem vollständigen offenen Komplex ausgeweitet (D).

Initiation der Transkription

Abb.2: Schematische Darstellung der Vorgänge während der Initiation. A, Die RNAP (blau) wird zu der Promotorplattform (TBP, grün und TFB, grau) rekrutiert. B, Nach einer Umstrukturierung des Komplexes wird ein minimaler offener Komplex von dem Core-Enzym gebildet, der durch die Interaktion des Enzyms mit dem E’/F-Heterodimer (C) und dem damit verbundenen Schließen der Klammer (rot) in Richtung der Transkription ausgeweitet wird. D, TFE (gelb) bindet an den exponierten, nicht kodierenden Strang im Bereich der Transkriptionsblase stromaufwärts des Transkriptionsstartpunkts und induziert das Ausweiten der stromaufwärts gelegenen Grenze der Transkriptionsblase.

Mittels photochemischer Cross-Linking Studien konnte eine zusätzliche Funktion von TFE entdeckt werden, die für das ursprünglichste Mitglied der TFE-Familie einzigartig zu sein scheint. Eukaryotisches TFIIE wird während des Übergangs von Initiation zur produktiven RNA-Synthese aus dem Komplex freigesetzt. Archaeelles TFE hingegen bleibt als Teil des Elongationskomplexes an die RNAP gebunden und stabilisiert durch Interaktionen mit dem nicht kodierenden Strang die Transkriptionsblase in den ternären Komplexen (Abb. 3). Wie im eukaryotischen System ist eine nachträgliche Bindung von TFE an Elongationskomplexe nicht möglich, was bedeutet, dass TFE zu PICs rekrutiert werden muss, um eine funktionelle Wirkung auf die produktive RNA-Synthese zu haben.

TFE stabilisierter Transkriptionskomplex

Abb. 3: Schematische Darstellung eines TFE-stabilisierten Elongationskomplexes (RNAP, blau; TFE, gelb; nicht kodierender DNA-Strang, rot; kodierender Strang, schwarz). Der schwarze Balken stellt die Position der Pausierung und des aktiven Zentrums der RNAP dar. TFE interagiert mit der DNA des nicht kodierenden Strangs im Bereich der Transkriptionsblase von Elongationskomplexen.