Arbeitsgruppe Prof. Dr. M. Thomm
Mitarbeiter an diesem Thema: Annette Keese



Die Regulation der Hitzeschockantwort bei Pyrococcus furiosus

Im Mittelpunkt dieses Projektes steht der Pyrococcus heat shock regulator, Phr.
Er wurde von unserer Arbeitsgruppe als das erste archaeelle Regulatorprotein der Hitzeschockantwort beschrieben (Vierke, G., Engelmann, A., Hebbeln, C. and Thomm, M. (2003) J. Biol. Chem. 278, 18-26).
Der Regulator Phr hemmt die Transkription der Hitzeschockgene hsp 20 und aaa+ atpase. Außerdem hemmt Phr auch die Transkription seines eigenen Gens.
Durch EMSAs und Footprint Experimente konnte die Wirkungsweise von Phr aufgeklärt werden. Es wurde gezeigt, dass Phr auf dem Promotor direkt stromabwärts der ebenfalls an den Promotor bindenden archaeellen Transkriptionsfaktoren TBP und TFB bindet. Phr überlagert dabei den Transkriptionsstartpunkt und verhindert so die Bindung der Polymerase und damit die Transkription des Gens.

 

 

Vor kurzem wurde die Kristallstruktur von Phr veröffentlicht (Liu W., Vierke G., Wenke A., Thomm M. and Ladenstein R. (2007) J. Mol. Biol. 369, 474-488).
Der N-terminale Teil besteht aus einer winged helix DNA binding domain (wH-DBD), während der C-terminale durch eine lange a-Helix charakterisiert ist.

Um mehr Informationen über die Hitzeschockantwort von Pyrococcus furiosus zu erhalten, sollten in einem weiteren Projekt alle Gene, die von Phr reguliert werden, identifiziert werden.
Dies erfolgte durch eine Kombination von in vitro Transkription und Microarray Analyse; ROMA-Ansatz (Thomm (2007) Archaea: Molecular and Cellular Biology Edited by Ricardo Cavicchioli, ASM Press, Washington, D. C.)
Dazu wurde fragmentierte, chromosomale DNA von Pyrococcus furiosus mit und ohne Phr in vitro transkribiert. Die transkribierte RNA wurde mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen markiert und mit einem Microarray, der das gesamte Genom enthielt, hybridisiert. Die Transkription von zum Beispiel den Hitzeschockgenen wurde von Phr gehemmt. Durch den Vergleich einer Transkription ohne und einer Transkription mit Regulator konnten weitere Gene, die von Phr reguliert werden, identifiziert werden.
Die Microarray Analysen erfolgten in Kooperation mit Dr. Gerrit Schut, Arbeitsgruppe Prof. Dr. Mike Adams, University of Georgia, Athens.