Forschungstätigkeit

Tissue engineering - Herstellung von künstlichen Geweben für die Biomedizin

Ein neues Wissenschaftsfeld etabliert sich innerhalb der Biomedizin. Zellbiologen, Bioingenieure und Chirurgen arbeiten in einem Team. Im Focus steht das Tissue engineering, bei dem künstliche Binde- und Epithelgewebe, sowie neuronale Organoide auf der Basis von kultivierten Zellen und mit Hilfe verschiedenster Biomatrices hergestellt werden. Eine Reihe von Firmen und zahlreiche Forschunglaboratorien sorgen für eine überraschende Dynamik bei der Forschung und im Anwendungsbereich. Wirtschaftsprognosen sagen voraus, dass bereits am Anfang des kommenden Jahrhunderts das Tissue engineering eine vergleichbare kommerzielle Bedeutung wie die heutige Gentechnologie erreichen wird.

Ein riesiger Bedarf an 'Ersatzteilen' für den menschlichen Körper motiviert zur Forschung. Innovative Techniken und kreative Lösungen werden verlangt. Am weitesten fortgeschritten ist die Herstellung von vitalem Hautersatz für Patienten mit schweren Verbrennungen. Es folgt die Generierung von patienteneigenen Knorpeltransplantaten bei Verletzungen bzw. Veränderungen der Gelenkoberflächen oder bei notwendigen Operationen im Hals-, Nasen- und Ohrenbereich. Zukünftige Herausforderungen sind artifizielle Leberorganoide zur Überbrückung von Komazuständen oder die Entwicklung einer künstlichen Niere auf der Basis kultivierter Tubuluszellen für eine optimierte Dialysebehandlung. Interagierende Gewebesysteme als eine optimale Alternative zu Experimenten an Tieren sind bereits praktische Realität.

Vorgestellt wird die experimentelle Durchführung einer Auswahl an aktuellen Tissue engineering - Experimenten. Neuartige Gewebeträger und Kulturtechniken bieten beste Voraussetzungen zur Entwicklung von komplexen Gewebe- und Organstrukturen. Dadurch eröffneten sich völlig neue Perspektiven in der Grundlagenforschung. Möglich werden dadurch auch erstmalig Langzeituntersuchungen in der Biomaterialforschung und Untersuchungen zur chronischern Intoxikation unter in vitro Bedingungen.

In den USA entstehen ca. 400 Mrd $ jährliche Kosten durch Organ- und Gewebeschäden, ausserdem werden etwa 30 000 Fälle an Leberversagen diagnostiziert [1]. Etwa 10 Mio Einwohner der USA leben heute schon mit Implantaten, wobei jährlich weitere ca. 140 000 Hüftprothesen eingesetzt werden. Die jährlichen Kosten für Implantate aller chirurgischen Fachrichtungen beläuft sich auf 30 Mrd $. Für Deutschland liegen nur inoffizielle Zahlen vor. Pro Jahr werden ca. 20 000 Knieprothesen eingesetzt und mehr als 100 000 relevante Knorpelschäden an Gelenken sind pro Jahr karteikundig.

Bei Knorpelschäden des Hüftgelenkes werden Prothesen aus Metall verwendet. Für Blutgefässe und harnableitende Strukturen dienen Implantate aus verschiedensten Kunststoffen [2]. Da es sich dabei um körperfremde Materialien handelt, sind Entzündungserscheinungen und Abstossungsreaktionen, sowie Komplikationen bei der Blutgerinnung immer wieder zu beobachten. Naheliegend ist deshalb, Implantate aus kultivierten Zellen ausserhalb des Körpers herzustellen und sie dann zu implantieren.

Diese neue Möglichkeit eröffnet das Tissue engineering. Es basiert auf der Idee, patienteneigene Zellen auf geeignete Matrices aufzubringen, ihre Vermehrung zu steuern und ihre dreidimensionale Ausbreitung zu lenken. Mit dieser Technik lassen sich somit räumlich definierte Gewebe und organoide Strukturen für die Implantation aufbauen. Solche vitalen Konstrukte entstehen in der interdisziplinären Zusammenarbeit zwischen der Biomaterialentwicklung, der Zellbiologie und der Zellkulturtechnik.

Von der Zellkultur zum Tissue engineering

Schon seit über 50 Jahre gibt es Methoden, Zellen aus tierischen oder menschlichen Gewebe- und Organteile zu isolieren und unter Kulturbedingungen am Leben zu erhalten [3]. Meist werden die Zellen mit wachstums- oder serumhaltigen Medium in einer Kulturschale gefüttert, um eine möglichst schnelle Zellvermehrung zu erhalten. Auf diese Weise lassen sich Zellen in beliebiger Menge gewinnen. Beim Arbeiten stellt man jedoch häufig fest, dass sich die Zellen in der Kulturschale zwar vermehrt haben, viele Eigenschaften aber durch Dedifferenzierung verloren haben [4]. Isolierte Knorpelzellen bilden z.B. keine oder nur noch eine atypische Knorpelgrundsubstanz. Kultivierte Leberparenchymzellen zeigen nach ihrer Isolierung nur noch einen Bruchteil ihrer ursprünglichen Entgiftungsleistung, Darmepithel- oder Nierentubuluszellen können nicht mehr in der bekannten Weise Stoffe aufnehmen und haben wesentliche Transport- sowie Abdichtungsfunktionen verloren. Dadurch wird deutlich, dass mit der bisherigen angewandten Technik in den konventionellen Kulturgefässen keine funktionellen Gewebe hergestellt werden können.

Strategie für das Tissue engineering

Bei der Herstellung von funktionellen Geweben muss nach unseren experimentellen Erfahrungen in drei Schritten vorgegangen werden (Tabelle 1). Im ersten Schritt erfolgt in konventionellen Kulturgefässen eine Vermehrung der jeweils benötigten Zellen. In einem zweiten Schritt werden die amplifizierten Zellen auf einer optimalen Gewebeunterlage aufgebracht. Für eine gewebetypische Differenzierung ist eine optimale Zellverankerung die wesentliche Voraussetzung [5]. Um das Gewebe gut handhaben zu können werden die Unterlagen in einen Träger montiert (Fig.1). Danach werden die Gewebeträger in Perfusionscontainer eingesetzt und permanent mit frischen Kulturmedium durchströmt (Fig.2,3). In diesen Containern lässt sich auf beliebige Weise gewebetypisches Environment simulieren.

Steuerung der Differenzierung

Das Tissue engineering für biomedizinische Anwendungen verlangt die Herstellung von Implantaten mit speziellen Eigenschaften, die im Körper wie selbstverständlich vorkommen, unter in vitro Bedingungen aber nur unvollstängig ausgebildet werden. Der zentrale Punkt beim Tissue engineering ist deshalb die Steuerung der Differenzierung in kultiviertem Gewebe (Tabelle 2). Die Expression und der Erhalt von gewebetypischen Eigenschaften kann entscheidend durch die Zellverankerung und damit durch die Gewebeunterlage beeinflusst werden [5,6.7]. Besonders gute Erfolge erzielten wir mit einer optimalen Verankerung der Zellen auf individuell ausgesuchten Filterunterlagen, Vliesen, bioabbaubaren Polymeren oder schwammartigen Matrices [2,8,9]. Die Zellen nutzen die Filteroberfläche als zweidimensionale Wachstumsfläche, während Mikrofasern eine dreidimensionale Ausbreitung ermöglichen. Somit kann einem entstehenden Gewebe eine definierte Wachstums- und Ausbreitungsrichtung vorgegeben werden. Eine weitergehende Verbesserung der Zellverankerung findet statt, wenn die verschiedenen Unterlagematerialien mit Proteinen der extrazellulären Matrix beschichtet werden [10]. Um die Supporte mit den kultivierten Gewebe problemlos handhaben zu können, haben wir spezielle Träger entwickelt [5]. Um während der Kultur stoffwechselschädigende Metaboliten zu entfernen, können die Gewebeträger in Kulturcontainer überführt werden, die permanent mit frischem Kulturmedium durchströmt werden (Fig.2,3) [11]. Durch die permanente Erneuerung des Kulturmediums wird zudem das Angebot an Nährstoffen kontrollierbar und die Anhäufung von parakrin gebildeten Faktoren auf gleichmässig niedrigem Niveau gehalten. Primärkulturen können in den Perfusionscontainer mit dieser Methode in der für sie typischen Kontaktinhibierung über Wochen und Monate ohne eine Subkultivation gehalten werden. Eine weitergehende Differenzierungssteuerung erreichen wir durch Zugabe von löslichen Differenzierungsfaktoren und Hormonen ins Kulturmedium [12,13]. Wachstumsfaktoren oder Serumzusätze zum Kulturmedium werden von uns nur verwendet, wenn eine Proliferation der Zellen zur Vermehrung von Biomasse gewünscht ist. Um Mitosestress und damit eine Downregulierung der Differenzierung zu vermeiden, wird deshalb serumarmes oder serumfreies Medien in der Perfusionskultur verwendet. Ganz entscheidend für die Generierung von funktionellen Geweben war die Erfahrung, dass nicht ein einzelner Faktor, sondern nur eine konsequente Verbesserung der gesamten Kulturtechnik auch zu einer verbesserten Gewebedifferenzierung führt. Grundlage dafür ist die Erkenntnis, dass die Steuerung und Aufrechterhaltung der Differenzierung auf ganz unterschiedlichen zellulären Ebenen stattfindet.

Beim Tissue engineering muss entschieden werden, ob sich die Zellen dauernd teilen, oder in der natürlichen Kontaktinhibierung der Interphase verweilen sollen. Denn nur in dieser Interphase werden viele typischen Gewebefunktionen exprimiert und aufrechterhalten. Deshalb versuchen wir das Gleichgewicht zwischen Proliferation und Differenzierung von Zellen in vitro dem jeweiligen Proliferationszyklus der Gewebezellen durch Entzug oder Zugabe von mitogenen Stimuli anzupassen.

Praktische Durchführung

Für die Herstellung von künstlichen Geweben wird zuerst eine Unterlage mit einem Durchmesser von 13 mm ausgesucht. Dieser Support muss den Zellen eine optimale Verankerung ermöglichen. Die Unterlage wird dann in einen Gewebeträger (Fig.1) eingelegt und sterilisiert. Anschliessend werden die Zellen aufpipettiert. Nach dem Anheften der Zellen werden die Gewebeträger in Perfusionscontainer eingesetzt (Fig.2). Statt isolierter Zellen können genausogut Gewebeschnitte oder Explantate auf eine Nylongaze aufgelegt werden, die sich in der Gewebeträgerhalterung befindet (Fig.1). Mit einer zweiten Gaze wird dann das Gewebe abgedeckt und wie in einem Sandwich in der Halterung fixiert. Die Gewebeträger werden dann ebenfalls in einen Perfusionscontainer eingesetzt (Fig.2,3). Eine Wärmeplatte bringt die Kulturen auf 37°C. Eine Peristaltikpumpe transportiert kontinuierlich frisches Kulturmedium aus einer Vorratsflasche in den Container, während das verbrauchte Medium in eine Abfallflasche fliesst. Da CO2-unabhängiges Kulturmedium verwendet wird, kann die Perfusionskultur ausserhalb eines Inkubators auf jedem Labortisch für Wochen und Monate durchgeführt werden.

Epithelzellen können wie unter natürlichen Bedingungen zwischen zwei unterschiedlichen Kompartimenten angesiedelt werden. Dazu wurde ein Gradientencontainer mit 6 Gewebeplätzen entwickelt (Fig.3). Mit einer Pinzette werden die Gewebeträger in die Gradientenkammer eingelegt (Fig.3a), dann wird der Deckel geschlossen. Die Kammer wird durch den Gewebeträger in ein oberes und unteres Kompartiment geteilt. Luminal und basal können ganz unterschiedliche Kulturmedien perfundiert und somit individuelle organspezifische Bedingungen für die eingelegten Epithelien simuliert werden (Fig.3b).

Generierung von Binde- und Stützgeweben

Mit der vorgestellten Methode gelang es erstmalig, gewebetypischen Knorpel herzustellen, um ihn für chirurgische Implantationszwecke zu nutzen [8,9,17]. In einem ersten Schritt wird von einem Patienten ein kleines Stück Knorpelgewebe isoliert und die Zellen in konventionellen Kulturgefässen vermehrt. In einem zweiten Schritt werden dann die Knorpelzellen auf einem bioabbaubaren Vlies ausgesäht. Das Vlies wurde vorher so geformt, dass es später problemlos in eine Gelenkoberfläche, in eine Nasen- oder Ohrverletzung eingesetzt werden kann. In einem dritten Schritt werden die Gewebeträger dann in einen Perfusioncontainer eingesetzt. Während der Perfusionkultur bildet sich typisches und mechanisch belastbares Knorpelgewebe. Da es sich bei diesem Verfahren um patienteneigene Zellen handelt, sind zu erwartende Abstossungs- und Entzündungsreaktionen nach Implantation auf ein Minimum reduziert. Auf ähnliche Weise lassen sich in Zukunft sicherlich auch körpereigene Knochenimplantate herstellen, die z.B. bei Splitterbrüchen als Heilungshilfen eingesetzt werden könnten. Realisierbar erscheinen ausserdem künstlich hergestellte Sehnen und Bänder.

Generierung von funktionellen Epithelien

Neben den Binde- und Stützgeweben sind die Epithelien von grosser Bedeutung für unsere Körperfunktionen. Epithelien sind immer an Stellen zu finden, wo Austausch- und Schutzfunktionen in unseren Körper ablaufen. Als Beispiele dienen die schützende Haut, das gasaustauschende Alveolarepithel der Lunge, die resorbierende Zellschicht in der Innenauskleidung des Darmtraktes und die urinausscheidenden Epithelien in der Niere. Das luminale und basale Environment aller Epithelien unterscheidet sich deutlich. Beispielsweise sind die Zellen in der Niere luminal einem urin- und basal einem serumartigen Umgebungsmilieu ausgesetzt. Genau diese Bedingungen lassen sich mit einem neu entwickelten Gradientencontainer simulieren (Fig.3) [11]. Dazu wird ein Gewebeträger mit einem Nierenepithel in die Gradientenkammer eingelegt. Wie unter natürlichen Bedingungen wird an den Zellen von oben ein urin- und von unten ein serumartiges Kulturmedium vorbeigeströmt. Mit dieser Methode gelang es, ein eindeutig definiertes Epithel aus embryonalen Zellen des Sammelrohr der Säugerniere mit seinen unterschiedlichen Zelltypen herzustellen und über Wochen und Monate in seiner typischen Form zu erhalten [18].

Bei immer knapper werdenden Nierentransplantaten muss an die Herstellung eines artifiziellen Dialysemoduls auf der Basis von patienteneignen und kultivierten Zellen gedacht werden. Die bisher angewendete Dialysetechnik basiert auf einem physikalischen Filter, bei dem harnpflichtige Substanzen durch die Poren abgeschieden werden. Ein Teil dieser Substanzen gelangt aber durch Rückdiffusion, also auf dem gleichen Weg wieder zurück in den Körper. Bei einem Dialysemodul mit kultivierten Nierenzellen würde das nicht geschehen. Ein Molekül wie z.B. Harnstoff würde in einer Ventilfunktion durch die Epithelbarriere transportiert und könnte nicht wieder zurückgelangen. Ein solches Modul mit Zellen des Patienten könnte zur Verkürzung und damit zur Effizienzsteigerung zum bisherigen Dialysemodul zugeschaltet werden.

Generierung von Gefässen

Grössere Organstrukturen können nur dann entwickelt werden, wenn alle Zellen optimal mit Sauerstoff und Nahrung versorgt werden. Über die Entstehung und Wachstumssteuerung solcher Gefässnetze, speziell in der Niere ist nur sehr wenig bekannt. Versuche zur Entstehung des Gefässnetzes der Niere gelingen zudem in der konventionellen Kulturschale nicht. Um dennoch solche Vorgänge untersuchen zu können, wurde embryonales Nierengewebe in Gewebeträger und Perfusionscontainer eingesetzt [13,19]. Die Versuche ergaben, dass erstmalig ein sprossendes Gefässnetz der Niere unter diesen verbesserten Kulturbedingungen generiert werden konnte. Mit Wachstumsfaktoren wie z.B. VEGF (vascular endothelial growth factor) kann zudem die Ausbreitung des sprossenden Gefässnetzes stimuliert oder aber mit spezifischen Antikörpern blockiert werden. Damit konnten völlig neue Einblicke in die Entstehung der embryonalen Niere gewonnen werden. Es konnten zudem erste praktische Erfahrungen erarbeitet werden, wie später einmal experimentell ein artifizielles Gefässsystem in Interaktion mit einem Organparenchym entwickelt werden könnte. Bei der Entwicklung einer künstlichen Niere, Leber oder Bauchspeicheldrüse wird dieser Vorgang eine wesentliche Rolle spielen.

Interagierende Gewebesysteme

Die Mehrzahl der bisherigen Versuche mit kultivierten Zellen in einer Kulturschale lieferte keine direkte Übertragung von der in vitro auf die in vivo Situation. Einen wesentlichen Fortschritt bei der Entwicklung von in vitro Modellen als eine Alternative zu Experimenten an Tieren werden zukünftig interagierende künstliche Gewebe aus humanen Zellen liefern [20]. Darunter versteht man verschiedenartige Gewebe, deren Zellen über eine intakte extrazelluläre Matrix miteinander kommunizieren. Damit kann unter besonders realistischen Bedingungen besonders gut die Entstehung von Krankheitsprozessen untersucht werden. Es ist z.B. gelungen, interagierende dreidimensionale Kulturen aus Synovial- und Knorpelzellen herzustellen. Entlang einer histologisch klar erkennbaren Gewebekontaktzone können jetzt bei der Entstehung von rheumatoiden Erkrankungen lokale Veränderungen wie z.B. der Phänotyp von Zellen, die Degradation der extrazellulären Matrix, die Zytokinsekretion oder die Zellinvasion untersucht werden. Ein anderes Beispiel kommt aus dem Bereich der Biomaterialforschung und Zahnmedizin. In der Gradientenkammer (Fig.3) sind Langzeituntersuchungen zur Verträglichkeit von Medikamenten und Füllmaterialien bei der Zahnbehandlung möglich geworden [21]. Dazu verwendet man isolierte Dentinscheiben in Gradientencontainern (Fig.3) und lässt auf der einen Seite Mesenchymzellen wachsen. Auf der anderen Seite der Dentinscheibe können jetzt beliebige Behandlungs- und Füllmateralien aufgetragen werden. Sterben die Mesenchymzellen im Laufe einer definierten Zeit in der artifiziellen Pulpahöhle ab, so hat die jeweilige Testsubstanz die Bioverträglichkeitsprüfung unter diesen realistischen Bedingungen nicht bestanden.

Lebendkonservierung von Geweben

Bei Operationen im Kiefer- und Mundhöhlenbereich ist zur Abdeckung von Wundfeldern Bindegewebe und Gingiva Mangelware. Für grössere Eingriffe kann lebend konserviertes Patientengewebe hierzu eine Lösung bieten. Dazu wird Mundschleimhaut vor einer geplanten großflächigen Operation chirurgisch z.B. von der Wangeninnnenseite entnommen. Das Epithel wird in einen Gewebehalter eingespannt und kann für Wochen in einem Perfusionscontainer konserviert werden[22]. Inzwischen kann die Entnahmestelle in der Mundhöhle verheilen. Zum eigentlichen operativen Eingriff kann dann die in Perfusionskultur konservierte Gingiva verwertet und zur zusätzlichen Abdeckung von Wundflächen implantiert werden.

Vorteile bietet die neue Methode auch bei der Generierung von künstlichen Hirnhäuten oder bei verschiedensten gentherapeutischen Verfahren. Neue Märkte eröffnet das Tissue engineering für spezielle Institute in Kliniknähe, wo zukünftig patienteneigene Zellaufarbeitung und Tissue engineering professionell durchgeführt werden. Voraussetzung dafür sind innovative Verfahren und Produkte für die Gewebezucht, sowie eine grosse Auswahl an körperverträglichen Matrices, mit denen sich artifizielle und funktionsfähige Gewebe optimal herstellen lassen.

Eine neu entwickelte Technik bleibt nur von akademischem Interesse und bringt keinen weiteren Nutzen, wenn sie nicht verfügbar ist. Deshalb wurden wir von der Bayrischen Staatsregierung grosszügig unterstützt, unsere Neuentwicklungen auf international sehr angesehenen Messen wie der BIOTECHNICA 1991 in Hannover und der ANALYTICA 1992 in München auszustellen. Hierbei lernten wir eine überraschend grosse Zahl von Interessenten kennen, die mit der neuen Technik arbeiten wollten.

Da aber trotz intensiver Bemühungen und mehrerer Patentanmeldungen kein geeigneter Hersteller und Vertriebspartner für die innovativen Produkte gefunden werden konnte, gründete schliesslich Frau Lorenz - Minuth 1994 die
MINUCELLS and MINUTISSUE Vertriebs GmbH,
Starenstr. 2, D - 93077 BAD ABBACH, Tel: 49 (0)9405 962440, Fax: 49 (0)9405 962441, e-mail:
minucells.minutissue@t-online.de
Seit dieser Zeit haben ca. 300 verschiedene Arbeitsgruppen Produkte für die organtypische Kulturtechnik erworben. Das Zellkultursystem ist inzwischen weit über den deutschen Sprachraum hinaus bekannt. Wissenschaftler aus Universitäten und der Pharmaindustrie zwischen Hong Kong, Vancouver and Santiago nutzen die High Tech Produkte aus Bad Abbach.

Literatur zum oben stehenden Artikel

Tissue Factory (PDF)

Aktuelle Literatur 

W.W. Minuth, R. Strehl (2007) Technical and theoretical considerations about gradient perfusion culture for epithelia used in tissue engineering, biomaterial testing and pharmaceutical research. Biomed. Mater. 2:R1-R11.(PDF)

W.W. Minuth, L. Denk, A. Roessger (2009). Gradient perfusion culture - Simulating a tissue-specific environment for epithelia in biomedicine. J Epithelial Biology & Pharmacology 2:1-13.(PDF)

W.W. Minuth, L. Denk, A. Glashauser (2010). A modular culture system for the generation of multiple specialized tissues. Biomaterials 11:2945-2954.(PDF)